小鼠D型氨基酸氧化酶（DAAO）ELISA试剂盒参考说明书

一、试剂盒组成

1. 预包被微孔板：96孔，包被有针对DAAO的捕获抗体。

2. 标准品：已知浓度的DAAO标准品（如0-1000 pg/mL）。

3. 检测抗体：生物素标记的DAAO抗体。

4. 酶标试剂：HRP标记的链霉亲和素。

5. 底物A/B液：TMB显色底物。

6. 终止液：硫酸溶液（1M）。

7. 洗涤缓冲液：浓缩型（需稀释使用）。

8. 封板膜：防止蒸发。

9. 说明书：包含详细操作步骤及参数。

二、实验原理

基于双抗体夹心法，通过生物素-链霉亲和素放大系统检测小鼠DAAO：

1. 样本中的DAAO与包被抗体结合。

2. 加入生物素化检测抗体，形成“抗体-DAAO-检测抗体"复合物。

3. 链霉亲和素-HRP与生物素结合，催化底物显色。

4. 终止反应后，用酶标仪读取450nm吸光度（OD值），通过标准曲线计算样本浓度。

三、操作步骤

1. 样本准备

• 血清/血浆：离心分离（3000×g, 10分钟），取上清，避免溶血。

• 组织匀浆：匀浆后离心（12000×g, 20分钟），取上清，按说明书稀释。

• 细胞培养上清：离心去除细胞碎片，直接检测或稀释。

2. 标准品配制

• 将冻干标准品用标准品稀释液复溶，梯度稀释（如1000、500、250、125、62.5、31.25 pg/mL）。

3. 加样与孵育

1. 加样本/标准品：每孔100μL，设空白孔（不加样本，只加稀释液）。

2. 封板：覆膜，37℃温育90分钟。

3. 洗板：弃液，每孔加350μL洗涤液，静置30秒，甩干（重复3次）。

4. 加检测抗体

1. 每孔加100μL生物素化检测抗体（稀释后），37℃孵育60分钟。

2. 洗板（同上）。

5. 加酶标试剂

1. 每孔加100μL HRP-链霉亲和素，37℃孵育30分钟。

2. 洗板（5次）。

6. 显色与终止

1. 每孔加50μL底物A和B液，37℃避光孵育15分钟。

2. 加50μL终止液，10分钟内读取OD值（450nm，参考波长630nm）。

7. 结果计算

• 绘制标准曲线（Log浓度 vs. Log OD），用软件（如Curve Expert）拟合四参数方程。

• 样本浓度通过标准曲线反推。

四、注意事项

1. 试剂保存：未用试剂4℃保存，避免冷冻；标准品复溶后-20℃冻存（1周内用完）。

2. 温控：严格按37℃孵育时间操作，避免误差。

3. 避免交叉污染：加样时换枪头，洗板。

4. 显色控制：显色时间过长可能导致OD值过高，需统一时间终止反应。

5. 空白孔校正：以空白孔调零。

五、常见问题与解决

六、检测范围与灵敏度

• 检测范围：通常为31.25–1000 pg/mL（具体以说明书为准）。

• 灵敏度：检测限约15–30 pg/mL。

七、储存条件

• 未开封试剂盒：2–8℃保存，有效期6个月。

• 开封后：微孔板密封保存，其他试剂4℃存放，3个月内用完。