斑马鱼促甲状腺激素(TSH)elisa检测试剂盒的试验操作步骤

操作步骤：

‌试剂准备‌：

所有试剂盒组分提前从冰箱取出，平衡至室温（18-25℃）至少30分钟；将20×浓缩洗涤液用超纯水按1：20比例稀释，配制成1×工作洗涤液。

标准品复溶：向20ng/mL的TSH冻干粉标准品中加入1mL标准品稀释液，静置10分钟待溶解后，轻轻混匀，得到20ng/mL的标准品母液，再通过倍比稀释依次配制出10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.312ng/mL的梯度标准工作液。

‌加样温育‌：

提前设置空白孔、标准品孔、待测样本孔：空白孔不加任何液体，标准品孔每孔加入100μL不同浓度的梯度标准液，待测样本孔每孔加入100μL预处理好的样本上清。

轻轻晃动酶标板混匀，贴上封板膜，置于37℃恒温培养箱中温育‌60分钟‌。

洗板与抗体结合‌：

小心揭掉封板膜，弃去孔中液体，在吸水纸上拍干；每孔加满1×洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗板‌5次‌，最后一次拍干孔内残留液体。

每孔加入生物素标记检测抗体100μL（空白孔除外），重新贴好封板膜，37℃温育‌30分钟‌。

再次重复上述洗板操作5次，拍干孔内液体。

酶促反应与显色‌：

每孔加入HRP标记亲和素100μL（空白孔除外），封板后37℃温育‌30分钟‌。

第三次重复洗板操作5次，拍干所有孔内残留液体。

每孔依次加入底物显色液A、B各50μL，轻轻晃动混匀，37℃避光显色‌15-20分钟‌，此时可见标准品孔从高浓度到低浓度呈现明显的蓝色梯度。

终止与读数‌：

每孔加入终止液50μL，轻轻晃动混匀，此时蓝色转变为黄色。

用酶标仪在‌450nm波长‌下，15分钟内依次测定各孔的吸光度（OD值）。